一、請(qǐng)求的目的

水中大腸菌群的測(cè)定采用膜法。

二、基本原則

濾膜法是利用過(guò)濾器過(guò)濾水樣，將細(xì)菌截留在濾膜上，然后將濾膜放在合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，大腸菌群可以直接在膜上生長(zhǎng)，所以可以直接計(jì)算。所用濾膜為多孔硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，為水性濾膜，孔徑約為0.45μm。

三、測(cè)試原材料和設(shè)備

實(shí)驗(yàn)材料：一紅梅藍(lán)瓊脂平板或遠(yuǎn)藤瓊脂平板、倒置小套管乳糖蛋白胨發(fā)酵管）、滅菌水、河水或湖水；

設(shè)備：鑷子；夾子；燒杯；真空泵；濾膜；過(guò)濾器等

四、操作步驟

1.濾膜殺菌

將濾膜放入裝有蒸餾水的燒杯中，加熱煮沸15分鐘，共煮沸3次。煮沸兩次后，水洗2-3次，然后煮沸以洗去濾膜上的殘留溶劑。

2.過(guò)濾裝置

無(wú)菌過(guò)濾器底座、過(guò)濾膜、漏斗和過(guò)濾瓶安裝在無(wú)菌程序中，用無(wú)菌鑷子將過(guò)濾膜轉(zhuǎn)移到過(guò)濾器底部（浸入95%酒精中，火焰滅菌）。其他的可以直接用手或夾子操作，但不要觸摸伸入過(guò)濾瓶的橡膠塞部分，以免污染。

3. 將過(guò)濾瓶連接到真空泵。

4.加水樣過(guò)濾

對(duì)于直徑為50mm的過(guò)濾器，要過(guò)濾的水量一般需要較多的過(guò)濾裝置，50個(gè)以上的過(guò)濾器為宜。因此，最好使用多重過(guò)濾器，這樣可以減少錯(cuò)誤。一般可抽取300-500毫升的深井水或處理過(guò)的河水、湖水；比較干凈的河水或湖水可以取樣1-100ml；嚴(yán)重污染的水樣可以先稀釋；可以對(duì)未知的水樣進(jìn)行采樣。進(jìn)行三個(gè)稀釋，并為要計(jì)算的菌落數(shù)選擇適當(dāng)?shù)南♂?。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將100毫升相對(duì)干凈的河水或湖水加入過(guò)濾漏斗并加蓋。

5. 啟動(dòng)真空泵進(jìn)行油過(guò)濾。

6、抽完后，加入等量的無(wú)菌水，繼續(xù)過(guò)濾，以沖洗漏斗壁。

7. 過(guò)濾后關(guān)閉真空泵，用無(wú)菌鑷子夾住過(guò)濾器的邊緣，將沒(méi)有細(xì)菌的一面放在 Endo 瓊脂板或 Espresso blue 瓊脂板上。過(guò)濾器和介質(zhì)之間不得有氣泡。

8. 將板倒置并在 37°C 下孵育 22-24 小時(shí)。

9. 挑取符合大腸菌群特征的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。

10.顯微鏡下，革蘭氏陰性、無(wú)芽孢桿菌的菌落接種于乳糖蛋白發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。產(chǎn)酸產(chǎn)氣組大腸菌群呈陽(yáng)性。